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IHC染色/免疫組化

抗原抗體反應(yīng),即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)),對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量。

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實(shí)驗(yàn)介紹

【技術(shù)原理】

抗原抗體反應(yīng),即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)),對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量。


【實(shí)驗(yàn)流程】


IHC免疫組化.png

案例展示


ihc染色.jpg

 

技術(shù)總結(jié)

 【常見(jiàn)問(wèn)題】

1、無(wú)/弱染色

     烤片溫度過(guò)高,推薦56℃-60℃1-2h;

     一抗是否適用固定液和石蠟切片,使用濃度是否過(guò)低,孵育是否時(shí)間過(guò)短等。


2、非特異性背景染色

    是否滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;

    孵育過(guò)程中干片;

    抗原熱修復(fù)過(guò)度。


3、染色過(guò)深

    一抗?jié)舛冗^(guò)高;
           染色試濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng);
           染色劑濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。



【注意事項(xiàng)】

1、使用3%過(guò)氧化氫溶液消除內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性時(shí),請(qǐng)勿孵育過(guò)長(zhǎng)時(shí)間,一般為5—10分鐘;

2、對(duì)于較易產(chǎn)生脫片的部分組織如皮膚、骨組織、腦組織等盡量避免使用微波修復(fù)和高壓修復(fù),減少其脫片的風(fēng)險(xiǎn);

3、使用DAB顯色時(shí),顯色劑停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成染色過(guò)深,可根據(jù)實(shí)驗(yàn)溫度及實(shí)驗(yàn)結(jié)果適當(dāng)調(diào)整染色時(shí)間。

送檢和交付標(biāo)準(zhǔn)

樣品類型樣品需求保存條件運(yùn)輸條件備注
新鮮組織新鮮取材組織,用 PBS 清洗干凈血液等,立即-80℃保存-80℃干冰所有樣本均須有唯一標(biāo)記,且標(biāo)記清晰可識(shí)
一般固定組織一般組織體積不超過(guò)2cmX2cmX0.5cm,固定時(shí)盡量保持組織的原有形態(tài)并清理干凈血液及多余部分,如腸道內(nèi)容物;固定液體積為組織大小的10倍以上,容器足夠容納組織不使其擠壓變形。標(biāo)注好固定液類型和固定時(shí)長(zhǎng)常溫常溫
特殊固定組織睪丸、眼球、脊髓、肌肉等組織:推薦使用對(duì)應(yīng)的特殊固定液進(jìn)行固定,以保證固定效果。如Bouin液,適用于睪丸組織、皮膚組織及眼球的固定

組織蠟塊組織由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋(尺寸為30*24*7mm),石蠟與組織要均勻接合,不能有裂痕;蠟塊厚度根據(jù)所需切片的數(shù)量而定,有效厚度至少要超過(guò) 0.1cm。盡量提供半年內(nèi)的組織蠟塊,超過(guò)半年的蠟塊抗原可能丟失,做免疫組化可能出現(xiàn)檢測(cè)不到蛋白。常溫常溫
組織切片需用防脫載玻片進(jìn)行撈片,并注明切片厚度、已烤片溫度與時(shí)間,組織應(yīng)在靠近切片下端 1/3 處。4℃冰袋
細(xì)胞爬片使用 12 孔板或 24 孔板專用細(xì)胞爬片,細(xì)胞爬片經(jīng)固定后用 PBS 洗滌 2~3 次,保存在 PBS 中,用封口膜密封孔板。每個(gè)爬片在孔板蓋上應(yīng)有唯一的標(biāo)記,并有電子版的分組信息,以防標(biāo)記在運(yùn)輸途中模糊。常溫常溫
植物樣本新鮮組織FAA固定,木質(zhì)化程度不高;對(duì)于較薄的葉片,如果要求平行葉片切片,難以保證切完整;根莖要求直徑>1mm常溫常溫
抗體保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識(shí)別此抗體的標(biāo)記,并附帶說(shuō)明書,抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。組織切片、組織芯片按稀釋后 100μl 一張切片計(jì)算抗體用量, 24 孔板細(xì)胞爬片圓形蓋玻片按稀釋后 200μl 一張計(jì)算抗體用量,12 孔板細(xì)胞爬片圓形蓋玻片按稀釋后 400μl 一張計(jì)算抗體用量。-20℃冰袋或干冰




病理交付標(biāo)準(zhǔn).jpg

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