穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建
將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標(biāo)志進(jìn)行篩選。最常用的真核表達(dá)載體的抗性篩選標(biāo)志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，篩選得到可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，或者穩(wěn)定表達(dá)沉默特定基因的細(xì)胞株。
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穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建
【應(yīng)用簡(jiǎn)介】
穩(wěn)轉(zhuǎn)株主要應(yīng)用于以下研究中：
1、需要長(zhǎng)期在目的細(xì)胞中研究基因功能。通過構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，也方便長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)研究；
2、部分蛋白半衰期及長(zhǎng)，瞬時(shí)RNA只能干擾表達(dá)，無法去除已經(jīng)表達(dá)的目的蛋白，通過構(gòu)建穩(wěn)定株可以實(shí)驗(yàn)更好的基因干擾效果；
3、瞬轉(zhuǎn)會(huì)引入不可預(yù)期的拷貝數(shù)表達(dá)（往往瞬時(shí)表達(dá)較高），導(dǎo)致因?yàn)槿藶橐蛩卦斐蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果的不精確，構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選到拷貝數(shù)適量的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；
4、穩(wěn)轉(zhuǎn)株可以用于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)，用于控制基因的時(shí)空表達(dá)；
5、需要用目的細(xì)胞構(gòu)建動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)，往往需要構(gòu)建成穩(wěn)定株。
【原理介紹】
將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標(biāo)志進(jìn)行篩選。最常用的真核表達(dá)載體的抗性篩選標(biāo)志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，篩選得到可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，或者穩(wěn)定表達(dá)沉默特定基因的細(xì)胞株。
慢病毒幾乎可以感染所有種類的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)，因此，慢病毒常用于制備穩(wěn)定表達(dá)/沉默特定基因的單克隆細(xì)胞株。
【實(shí)驗(yàn)方法】
1、目的細(xì)胞的合適抗生素濃度篩選；
2、目的細(xì)胞的合適病毒滴度篩選；
3、慢病毒構(gòu)建與包裝與滴度測(cè)定；
4、慢病毒感染；
5、特定抗生素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株；
6、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株鑒定。
案例展示
Hela細(xì)胞多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株
多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株的熒光通常強(qiáng)弱夾雜，從感染72小時(shí)后開始加入篩選藥物，每隔2天重新?lián)Q液加入篩選藥物。藥物篩選需至少持續(xù)14天，直至顯微鏡下觀察到的熒光細(xì)胞比例為100%。
技術(shù)總結(jié)
穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建是一個(gè)長(zhǎng)時(shí)間多平臺(tái)合作的項(xiàng)目，有多種因素容易導(dǎo)致穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建失敗：
1、支原體污染問題
細(xì)胞支原體輕度的污染不會(huì)影響細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，但是在病毒感染后容易大規(guī)模爆發(fā)，進(jìn)而導(dǎo)致穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建失??；
2、慢病毒保存不當(dāng)
3、慢病毒制備好后需及時(shí)分裝并放置于-80℃保存，避免反復(fù)凍融；
4、目的基因表達(dá)水平低
5、細(xì)胞感染病毒后毒性大導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
送樣與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 凍存細(xì)胞 | 1.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化離心收集細(xì)胞，加入凍存液吹打混勻，裝入凍存管，標(biāo)明細(xì)胞名稱/細(xì)胞代數(shù)，凍存細(xì)胞數(shù)量在1-5*106個(gè)/ml。 2.項(xiàng)目啟動(dòng)后細(xì)胞復(fù)蘇，復(fù)蘇后3天反饋細(xì)胞狀態(tài)，3-5天反饋細(xì)胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細(xì)胞詳細(xì)信息（名稱、培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件等，如經(jīng)過特別處理需告知并提供必要的信息） | 液氮 | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識(shí) |
| 復(fù)蘇后細(xì)胞 | 1.使用T25培養(yǎng)瓶運(yùn)輸。細(xì)胞匯合度達(dá)到60%以上，裝滿培養(yǎng)液，只留紐扣大小的氣泡，瓶口用封口膜封好，標(biāo)明細(xì)胞名稱/細(xì)胞代數(shù)/接種時(shí)間/培養(yǎng)基類型，瓶子固定運(yùn)輸。 2.收到細(xì)胞后3天反饋細(xì)胞狀態(tài)，3-5天反饋細(xì)胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細(xì)胞詳細(xì)信息（名稱、培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件等，如經(jīng)過特別處理需告知并提供必要的信息） | 常溫 | 常溫 | |
| 質(zhì)粒 | 1.純度高，無內(nèi)毒素，無蛋白質(zhì)，基因組DNA/RNA污染，質(zhì)粒A260:A280的比值在1.8-2.0之間 2.濃度不低于0.5μg/μl，總量大于100μg，無內(nèi)毒素處理 3. 載體詳細(xì)信息，包括名稱、大小、抗性、熒光標(biāo)記 | -20℃ | 冰袋 | |
| 病毒 | 1.慢病毒：滴度不低于1*108TU/ml，體積約200μl，標(biāo)明制備時(shí)間，且沒有反復(fù)凍融 2.腺病毒：滴度不低于1*109PFU/ml，體積約200μl，標(biāo)明制備時(shí)間，且沒有反復(fù)凍融 3.明確是否表達(dá)熒光標(biāo)簽蛋白及其種類，最好需要提供病毒載體圖譜； | -80℃ | 干冰 |
電話：400-691-6686
在線時(shí)間：8:00-24:00
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