? SNP
單核苷酸多態(tài)性主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類(lèi)可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類(lèi)基因組中廣泛存在，平均每300個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬(wàn)個(gè)甚至更多。SNP是一種二態(tài)的標(biāo)記，由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或顛換所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。SNP既可能在基因序列內(nèi)，也可能在基因以外的非編碼序列上。
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taqman探針?lè)ǎ?/strong>針對(duì)染色體上的不同SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)PCR引物和TaqMan探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。探針的5’-端和3’-端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。當(dāng)溶液中存在PCR產(chǎn)物時(shí)，該探針與模板退火，即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物，從而將探針5’-端連接的熒光分子從探針上切割下來(lái)，破壞兩熒光分子間的PRET，發(fā)出熒光。通常用于少量SNP位點(diǎn)分析。
高分辨率熔解曲線(xiàn)分析（HRM）是近幾年興起的SNP研究工具，它通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)升溫過(guò)程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況，來(lái)判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點(diǎn)、是否是雜合子等都會(huì)影響熔解曲線(xiàn)的峰形，因此HRM分析能夠有效區(qū)分不同SNP位點(diǎn)與不同基因型。這種檢測(cè)方法不受突變堿基位點(diǎn)與類(lèi)型的局限，無(wú)需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨率熔解，即可完成對(duì)樣品基因型的分析。該方法無(wú)需設(shè)計(jì)探針，操作簡(jiǎn)便、快速，成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作。
圖：某基因的SNP（G>A）進(jìn)行HRM分析的結(jié)果。左圖為熔解曲線(xiàn)，右圖為差異圖
SNaPshot法：是基于熒光標(biāo)記單堿基延伸原理的分型技術(shù)，也稱(chēng)小測(cè)序，主要針對(duì)中等通量的SNP分型項(xiàng)目。在一個(gè)含有測(cè)序酶、四種熒光標(biāo)記ddNTP、緊臨多態(tài)位點(diǎn)5’-端的不同長(zhǎng)度延伸引物和PCR產(chǎn)物模板的反應(yīng)體系中，引物延伸一個(gè)堿基即終止，經(jīng)ABI測(cè)序儀檢測(cè)后，根據(jù)峰的移動(dòng)位置確定該延伸產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)，根據(jù)峰的顏色可得知摻入的堿基種類(lèi)，從而確定該樣本的基因型。對(duì)于PCR產(chǎn)物模板可通過(guò)多重PCR反應(yīng)體系來(lái)獲得。通常用于10-30個(gè)SNP位點(diǎn)分析（見(jiàn)下圖）。
直接測(cè)序法：在所有SNP的檢測(cè)方法中，對(duì)待檢測(cè)片段進(jìn)行直接擴(kuò)增、測(cè)序是最為準(zhǔn)確的方法，也是SNP分析的金標(biāo)準(zhǔn)。純合型SNP位點(diǎn)的測(cè)序峰為單一峰型，而雜合型SNP位點(diǎn)的測(cè)序峰為套峰，因而很容易將其區(qū)分開(kāi)來(lái)。通過(guò)直接測(cè)序方法進(jìn)行SNP檢測(cè)的檢出率接近100%。該技術(shù)主要通過(guò)直接測(cè)序的方法來(lái)確定位點(diǎn)的基因型，這種分型方法準(zhǔn)確性最高，但費(fèi)用大。如果需要檢測(cè)的幾個(gè)SNP位點(diǎn)正好位于一個(gè)測(cè)序單元內(nèi)(長(zhǎng)度小于700bp)，則單個(gè)位點(diǎn)的分型費(fèi)用可顯著降低，這種分型技術(shù)不失為一種良好選擇。對(duì)于準(zhǔn)確性要求特別高或樣本量特別小(幾個(gè)或幾十個(gè))的項(xiàng)目，這種分型技術(shù)很適合。
【實(shí)驗(yàn)流程】
探針匹配：可以收集熒光；
探針不匹配：不能收集熒光。
案例展示
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類(lèi)型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動(dòng)物組織 | 單個(gè)樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過(guò)量；樣本應(yīng)盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識(shí) |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個(gè)樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標(biāo)、線(xiàn)粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標(biāo)，樣本盡量新鮮，細(xì)胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測(cè)）或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過(guò) 10μm，2~8 張，表面積不超過(guò) 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿(mǎn)足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體； 2. 按抗體說(shuō)明書(shū)要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并提供抗體說(shuō)明書(shū)。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識(shí)別此抗體的標(biāo)記，抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)基因至少提供兩對(duì)引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話(huà)：400-691-6686
在線(xiàn)時(shí)間：8:00-24:00
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