CCK8/mtt/細(xì)胞增殖檢測(cè)
MTT，CCK-8，BrdU，EdU等方法是常見(jiàn)的細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)，分別從代謝活性和DNA合成的角度來(lái)反應(yīng)細(xì)胞的增殖情況。MTT和CCK-8檢測(cè)原理為活細(xì)胞線(xiàn)粒體中的一些脫氫酶能使檢測(cè)試劑還原為甲瓚，而死細(xì)胞無(wú)此功能。BrdU和EdU則能都在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復(fù)制的DNA分子，通過(guò)基于與熒光染料的特異性反應(yīng)檢測(cè)DNA復(fù)制活性。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【應(yīng)用簡(jiǎn)介】
細(xì)胞增殖是生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)，與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等是腫瘤研究的重要表型，同時(shí)也是分子生物學(xué)和藥理學(xué)研究的重要內(nèi)容。MTT或CCK8是檢測(cè)細(xì)胞增殖的常用手段，可研究藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用；或探究過(guò)表達(dá)或干擾細(xì)胞中某個(gè)基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響，為進(jìn)一步研究基因的功能提供依據(jù)等。
【MTT技術(shù)原理】
MTT(噻唑藍(lán))，可透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，活細(xì)胞線(xiàn)粒體中的脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能；結(jié)晶物能溶于DMSO中，通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量（一定范圍內(nèi)，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)）。
【CCK8技術(shù)原理】
CCK-8試劑中的WST-8，可在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被活細(xì)胞線(xiàn)粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物；用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞量（一定范圍內(nèi)生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比）。
【實(shí)驗(yàn)方法】
Step1：細(xì)胞培養(yǎng)及狀態(tài)調(diào)整；
Step2：鋪板；
Step3：過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁及穩(wěn)定；
Step4：藥物處理；
Step5：MTT呈色：避光加MTT溶液，37℃孵育4 h，孵育完成后除盡孔內(nèi)上清，每孔加150μL DMSO，振蕩10min；
CCK-8呈色：避光加CCK-8溶液，孵育37℃ 1-4 h；
Step6：上機(jī)檢測(cè)：MTT-490nm；CCK8-450nm；
Step7：分析數(shù)據(jù)：以O(shè)D值或細(xì)胞相對(duì)存活率作圖。
注：如研究某基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響，采取先轉(zhuǎn)染后鋪板的原則。
案例展示
案例一：細(xì)胞相對(duì)存活率%
注：相對(duì)存活率%=（實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零孔OD值）/（空白組OD值-調(diào)零孔OD值）×100
*表示實(shí)驗(yàn)組與其對(duì)照組比較差異顯著（ 0.01＜P＜0.05）
**表示實(shí)驗(yàn)組與其對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0.01）
結(jié)果分析：
1、空載對(duì)照組與空白組無(wú)顯著差異，表明載體正常，對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。
2、過(guò)表達(dá)X基因可促進(jìn)目的細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組相比差異顯著。
案例二：IC50：指某一藥物或者物質(zhì)(抑制劑)在抑制某些生物程序（如酶、細(xì)胞受體、微生物）的半量，即50%抑制濃度。
結(jié)果分析：
1、當(dāng)A藥物處理目的細(xì)胞24h時(shí)，藥物的半數(shù)抑制濃度為31.39μg/mL；
2、當(dāng)A藥物處理目的細(xì)胞48h時(shí)，藥物的半數(shù)抑制濃度為9.98μg/mL。
技術(shù)總結(jié)
【常見(jiàn)問(wèn)題及注意事項(xiàng)】
1、鋪板密度不合理，均勻度不一致；
2、實(shí)驗(yàn)分組不嚴(yán)謹(jǐn)；
3、實(shí)驗(yàn)設(shè)置時(shí)間點(diǎn)不合理；
4、MTT或CCK8加樣時(shí)注意事項(xiàng)不明確；
5、血清等影響：高濃度血清或藥物顏色會(huì)影響試驗(yàn)孔的吸光度值；
6、邊緣效應(yīng)：邊緣孔的水分揮發(fā)較快，藥物易被濃縮。
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類(lèi)型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 凍存細(xì)胞 | 1.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化離心收集細(xì)胞，加入凍存液吹打混勻，裝入凍存管，標(biāo)明細(xì)胞名稱(chēng)/細(xì)胞代數(shù)，凍存細(xì)胞數(shù)量在1-5*106個(gè)/ml。 2.項(xiàng)目啟動(dòng)后細(xì)胞復(fù)蘇，復(fù)蘇后3天反饋細(xì)胞狀態(tài)，3-5天反饋細(xì)胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細(xì)胞詳細(xì)信息（名稱(chēng)、培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件等，如經(jīng)過(guò)特別處理需告知并提供必要的信息） | 液氮 | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識(shí) |
| 復(fù)蘇后細(xì)胞 | 1.使用T25培養(yǎng)瓶運(yùn)輸。細(xì)胞匯合度達(dá)到60%以上，裝滿(mǎn)培養(yǎng)液，只留紐扣大小的氣泡，瓶口用封口膜封好，標(biāo)明細(xì)胞名稱(chēng)/細(xì)胞代數(shù)/接種時(shí)間/培養(yǎng)基類(lèi)型，瓶子固定運(yùn)輸。 2.收到細(xì)胞后3天反饋細(xì)胞狀態(tài)，3-5天反饋細(xì)胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細(xì)胞詳細(xì)信息（名稱(chēng)、培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件等，如經(jīng)過(guò)特別處理需告知并提供必要的信息） | 常溫 | 常溫 | |
| 質(zhì)粒 | 1.純度高，無(wú)內(nèi)毒素，無(wú)蛋白質(zhì)，基因組DNA/RNA污染，質(zhì)粒A260:A280的比值在1.8-2.0之間 2.濃度不低于0.5μg/μl，總量大于100μg，無(wú)內(nèi)毒素處理 3. 載體詳細(xì)信息，包括名稱(chēng)、大小、抗性、熒光標(biāo)記 | -20℃ | 冰袋 | |
| 病毒 | 1.慢病毒：滴度不低于1*108TU/ml，體積約200μl，標(biāo)明制備時(shí)間，且沒(méi)有反復(fù)凍融 2.腺病毒：滴度不低于1*109PFU/ml，體積約200μl，標(biāo)明制備時(shí)間，且沒(méi)有反復(fù)凍融 3.明確是否表達(dá)熒光標(biāo)簽蛋白及其種類(lèi)，最好需要提供病毒載體圖譜； | -80℃ | 干冰 |
電話(huà)：400-691-6686
在線(xiàn)時(shí)間：8:00-24:00
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