實(shí)時(shí)熒光定量PCR
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結(jié)合的熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最終通過相對定量或絕對定量的方法確定各個樣本的本底表達(dá)量。qPCR檢測常用的兩種方法：染料法和TaqMan探針法。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【應(yīng)用簡介】
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結(jié)合的熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最終通過相對定量或絕對定量的方法確定各個樣本的本底表達(dá)量。qPCR檢測常用的兩種方法：染料法和TaqMan探針法。
【技術(shù)原理】
TaqMan探針法核心是探針分子，TaqMan探針是單鏈DNA，5’端偶聯(lián)發(fā)光基團(tuán)，3’端偶聯(lián)淬滅基團(tuán)，游離的完整探針是檢測不到熒光信號的，發(fā)光基團(tuán)發(fā)出的熒光會被淬滅基團(tuán)吸收淬滅，探針被水解，發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離就可以檢測到熒光信號。反應(yīng)開始時(shí)，模板鏈經(jīng)熱變性解鏈形成單鏈，TaqMan探針優(yōu)先跟模板鏈退火，引物隨后退火到模板上，之后進(jìn)行鏈的延伸，延伸過程中Taq酶發(fā)揮5’-3’外切酶活性，遇到探針會從5’端逐個堿基切除探針，發(fā)光基團(tuán)會跟淬滅基團(tuán)分開，因此熒光檢測系統(tǒng)可以接收到熒光信號，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，熒光信號的累積和PCR產(chǎn)物形成是同步的。
TaqMan探針法的特異性除了由引物提供，更由探針分子保證，因其退火溫度更高，所以TaqMan探針法特異性更好，在一個反應(yīng)體系中加入多條探針，可以做多個基因同時(shí)檢測。
【實(shí)驗(yàn)流程】
案例展示
結(jié)果分析：NTC組正常，表明QPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信，組間差異較小，操作合格。
常見問題
一、引物設(shè)計(jì)
1、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；
2、Taqman探針技術(shù)要求片段長度在50bp-150bp；
3、避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)。避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對；
4、典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性，較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55-65℃，GC含量在40%-60%；
5、引物之間的Tm值相差避免超過2°C；
6、引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基；
7、為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個外顯子；
8、探針位置盡可能地靠近上游引物；
9、探針的5'端應(yīng)避免使用堿基G，引物的3’端避免使用堿基A。探針長度通常在25~35bp，Tm值在65~70°C ,通常比引物Tm高5 ~10°C，GC含量在40%~ 70%；
10、整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量；
11、為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計(jì)好的序列在Blast中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)引物探針。
二、熱啟動
熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。
三、鎂離子濃度
鎂離子影響PCR的多個方面，如：對DNA聚合酶的活性的影響進(jìn)而影響產(chǎn)量;對引物退火的影響，進(jìn)而影響特異性。若dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，則降低了酶活性所需要的游離鎮(zhèn)離子的量。
四、模板質(zhì)量
模板的質(zhì)量會影響產(chǎn)量。DNA樣品中可能有多種污染物會抑制PCR。
五、防止殘余污染
1、PCR易受污染的影響，因?yàn)樗且环N敏感的擴(kuò)增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴(kuò)增。當(dāng)前一次擴(kuò)增產(chǎn)物用來進(jìn)行新的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，會發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其它樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源(非殘余污染)。
2、可以在PCR過程中使用良好的實(shí)驗(yàn)步驟減少殘余污染。為PCR樣品配制和擴(kuò)增后分析設(shè)計(jì)隔離的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套。總是使用不含有模板的陰性對照檢測污染。使用預(yù)先混合的反應(yīng)成份，而不是每個反應(yīng)的每個試劑單獨(dú)加入。
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動物組織 | 單個樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過量；樣本應(yīng)盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識 |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標(biāo)、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標(biāo)，樣本盡量新鮮，細(xì)胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測）或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過 10μm，2~8 張，表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體； 2. 按抗體說明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識別此抗體的標(biāo)記，抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個基因至少提供兩對引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時(shí)間：8:00-24:00
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